iSynBio造物聯合合成生物學競賽推出《大賽項目揭秘專題》，本期為第九期，嘉賓為廈門大學Synbio-XMU團隊，參賽項目為PTC疫苗有望挑戰所有病毒？

聯合發布：《合成生物學》期刊、生物世界、iSynBio愛星博、深圳市合成生物學協會。

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項目內容概述

在病毒的基因組多個基因位點突變成終止密碼子的序列，使得病毒在人體中的翻譯提前終止，無法產生完整的子代病毒。這種含有提前終止子PTC (Premature termination codon) 突變的病毒基因組和正常的病毒蛋白可以組裝出類病毒顆粒，即PTC類病毒或PTC疫苗。它沒有病毒毒性，但能引起人體產生高效免疫的武器。但現有PTC疫苗均無法突破在實驗室難以大量生產的問題。本項目首先設計并構建了能識別終止密碼子的ACE-tRNA，若將其引入酵母細胞，可以利用含有PTC位點的病毒基因組合成正常的病毒蛋白，有望解決PTC疫苗生產問題。

隨后，本項目通過PTC-GFP（含有提前終止子突變的GFP）作為報告基因驗證了識別終止密碼子的ACE-tRNA的有效性。同時還用Cas9技術改造了酵母的工程菌株。后續將以腸道病毒EV71為例，嘗試利用酵母細胞生產EV71-PTC疫苗。這些PTC疫苗生產工藝的改進有望應用到更多致病病毒相關的PTC疫苗開發。希望我們開發的PTC疫苗制備方法能促進疫苗學的研究，為全球公共衛生事業的發展和新冠疫苗的研發提供新的方案。

項目背景

據世衛組織公布的數據，截止2022年6月16日，全球共有超過200多個國家/地區累計新冠確診病例5.352億例，疫苗研發成為世界關注的焦點。目前五條疫苗研發技術路線，分別為滅活疫苗、減毒活疫苗、核酸疫苗、腺病毒載體疫苗和重組蛋白疫苗，但開發周期都比較長。PTC疫苗具有通用性，適用于多種病毒，可以通過多點突變的方式，快速研發，特別是急性感染病毒的疫苗開發有獨特的潛力。PTC疫苗為疫苗研發提供了新思路。

反密碼子編輯tRNA（ACE-tRNA，anticodon engineered transfer RNA）指反密碼子環序列經過人為改造的tRNA。本項目將絲氨酸Ser的tRNA的反密碼子改造為終止密碼子（UAG、UGA、UAA）。這三種ACE-tRNA能夠將PTC位點引入絲氨酸Ser，避免提前終止而產生正確的蛋白。將ACE-tRNA引入酵母細胞，則能將含有PTC位點的病毒基因組翻譯出正確的病毒蛋白，進而用于制備PTC疫苗。

無義介導的mRNA降解(NMD, nonsense-mediated mRNA decay)是指在病理或正常生理情況下mRNA上出現了提前終止密碼子(PTC)，從而導致mRNA降解的現象。它是一種廣泛存在的mRNA質量監控機制。mRNA在有提前終止密碼子PTC存在時，翻譯產生的截短蛋白往往具有細胞毒性，NMD的存在有助于避免截短蛋白的產生。為了提高外源基因mRNA（含有PTC位點）的穩定性，本項目開發了缺失NMD途徑的酵母底盤菌株。

項目總體技術路線

技術路線圖

1）正常的病毒基因組（不含PTC位點），能翻譯正常病毒蛋白，具有毒性和免疫原性。含有PTC位點的病毒基因組，只能翻譯出截斷的病毒蛋白，無法組裝出病毒。

2）含有PTC位點的病毒基因組，在有ACE-tRNA存在的情況下，能翻譯出正常的病毒蛋白。含有PTC位點的病毒基因組和正常的病毒蛋白可以組裝出PTC類病毒，即PTC疫苗。

3）利用Cas9技術敲除NAM7基因獲得缺失NMD途徑的酵母菌株，含有PTC位點外源基因的mRNA不容易被降解。

項目主要成果

1.設計并構建識別終止密碼子的ACE-tRNA

考慮到酵母中終止密碼子UAG、UAA、UGA密碼子豐度不同，我們將絲氨酸tRNA的反密碼子環設計為分別含有三種終止密碼子的ACE-tRNA。實驗中，我們將絲氨酸tRNA的基因克隆出來連接到質粒載體上，并引入終止密碼子相應的TAA、TGA、TAG突變，將三種突變的質粒轉化大腸桿菌獲得轉化子。（見下圖）

三種ACE-tRNA基因

(含終止密碼子相應的突變)質粒的轉化子

2.篩選對酵母毒性較小的ACE-tRNA

除了與外源基因的PTC位點的終止密碼子結合之外，三種ACE-tRNA還可能與酵母正常基因mRNA的終止密碼子結合，從而導致酵母蛋白的翻譯不能正確停止，產生大量無法正常終止而過長的無用蛋白，進而影響酵母生長速度，因此生長曲線的測定可以間接反映ACE-tRNA與正常終止tRNA的競爭情況。實驗表明UAA突變版本的ACE-tRNA對酵母毒性相比于UAG和UGA的更小。（見下圖）

三種突變long-tRNA與對照組OD600變化比較

3.構建報告基因突變版的GFP驗證ACE-tRNA的有效性

為了驗證ACE-tRNA的有效性，我們構建了將第147位點突變為終止密碼子的綠色熒光蛋白GFP，即PTC-GFP作為報告基因。將PTC-GFP和ACE-tRNA共轉到酵母細胞中，預期能夠成功翻譯終止密碼子的tNRA產出綠色熒光蛋白（見下圖）。但是，共轉的各實驗組中均未能觀察到明顯綠色熒光，僅有較弱的綠色熒光。經過分析酵母的NMD途徑的存在可能是共轉實驗未能得到較強的綠色熒光的原因。

報告基因PTC-GFP和ACE-tRNA共轉到酵母

示意圖

4.構建缺失NMD途徑的酵母作為PTC類病毒的生產底盤菌

利用cas9技術敲除NMD途徑關鍵基因NAM7（見下圖紅框）。

NAM7基因敲除的酵母細胞鑒定圖

隨后，在缺失NMD途徑的酵母中，共轉ACE-tRNA和PTC-GFP，獲得到較強的綠色熒光，相同條件下WT酵母菌株僅有極低的熒光效果（見下圖），相關數據圖標還在統計中。可見在缺失NMD途徑的酵母菌株中外源基因（含有PTC位點）的mRNA不容易被降解。

ACE-tRNA與PTC-GFP

共轉NMD途徑敲除的酵母

（左側是缺失NMD途徑敲除的菌株；中部是酵母WT菌株；右側是陰性對照）

鑒于目前的實驗結果，后續需對PTC類病毒顆粒的表達方案展開探究，檢測病毒免疫原性、進行動物實驗驗證PTC疫苗的有效性。后續也可借助tRNA的定向進化篩選出更高效的ACE-tRNA版本，為PTC疫苗研究提供重要思路。

項目完整內容（Wiki網頁）

http://www.synbiochallenges.com/wiki/2021/SynBioC_XMU/Protocol.html

我們是來自廈門大學的

Synbio-XMU團隊

王子傲（隊長）

廈門大學生命科學院學院本科生

魏翹楚

廈門大學公共衛生學院本科生

張丹麗

廈門大學生命科學學院研究生

吳娜

廈門大學生命科學學院本科生

夏伊瀾

廈門大學公共衛生學院本科生

曹宇

廈門大學公共衛生學院本科生，喜歡各類體育運動。

吳瀅潔

廈門大學信息學院軟件工程專業本科生

霍子軒

化學化工學院18級化學生物學系 Per Aspera Ad Astra

萬澄雨

廈門大學醫學院口腔醫學系2021級本科生

伍桐瑤

很開心能跟大家一起頭腦風暴，一起做實驗，一起進步！

陳智超

嘿呦what's up man~

劉桂杉

一個對世界充滿好奇心的未來醫生。

劉元媛

生活奇奇怪怪，而我可可愛愛。

馬躍

廈門大學20級生物科學交流生

陳權欣

清醒時做事，糊涂時讀書;

大怒時睡覺，獨處時思考。

#指導老師

袁吉峰

廈門大學生命科學學院

閩江學者特聘教授

#指導顧問

商志云

張子鈺

合成生物學是生命科學領域一門新興的前沿交叉學科和典型的匯聚技術。它通過融合工程科學理念與生命科學原理及基于多學科的使能技術，設計合成新的或改造天然的生命系統，揭示生命規律、構筑新一代工程生物體系；被喻為“認識生命的鑰匙”（造物致知）、改變未來的顛覆性技術（造物致用）。

合成生物學競賽-創新賽主要面向在校大學生以及在讀碩士研究生。本屆創新大賽包括醫療、農業、環境、制造、信息、基礎研究及創新應用等多個領域，鼓勵學生從興趣出發，探索合成生物學在不同領域的創新和應用。首屆創新大賽將于 2022 年 7月9-10日在深圳理工大學線下舉行。

大賽由中國生物工程學會合成生物學分會指導和主辦。大賽由二十多家高校和研究所共同發起。大賽的共同承辦單位是中國科學院深圳理工大學（籌）合成生物學院、中國科學院深圳先進技術研究院合成生物學研究所、深圳合成生物學創新研究院、深圳市合成生物學協會、 深圳市工程生物產業創新中心、DeepTech。大賽的支持單位為光明區委區政府。

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作者 |Synbio-XMU團隊

校對 |鯤

編輯 |果粒珍珍

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